紫外可见分光光度计定量分析方法

 

采用紫外可见分光光度计进行定量分析时，常用到①绝对法②标准法③比吸收系数法④标准曲线法⑤最小二乘法⑥解联立方程法⑦示差分光光度法7种分析方法，本文将就这7种方法进行详细的论述。

一、绝对法

目前，绝对法是紫外可见分光光度计诸多分析方法中使用最多的一种方法。这是一种以比耳定律A=εbC为基础的分析方法，某一物质在一定波长下ε值是一个常数，石英比色皿的光程是已知的，也是一个常数。因此，可用紫外可见分光光度计在λmax波长处，测定样品溶液的吸光度值A。然后，根据比耳定律求出C=A/εb，则可求得该样品溶液的含量或浓度。

二、标准法

在选定的波长处，在相同的测试条件下，分别测试标准样品溶液C标和被测试样品溶液C样的吸光度A标和A样。然后，按公式求得样品溶液的浓度或含量。

三、比吸收系数法

在药物分析中，经常采用比吸收系数法。比吸收系数法多用于测定样品溶液的浓度。但是，根据比耳定律，被测试样溶液的浓度与吸光度应成直线关系，而在实际测试中，如果试样的浓度较高，会发现实际测量到的吸光度值偏离线性关系。这种偏离比耳定律的原因，是由于紫外可见分光光度计的杂散光、噪声、基线平直度和光谱带宽，以及试样的前处理、试样的化学平衡等所引起的。因此，一般情况下，不采用这种方法。

四、标准曲线法

紫外可见分光光度计最常用的定量分析方法是标准曲线法。即先用标准物质配制一定浓度的溶液，再将该溶液配制成一系列的标准溶液。在一定波长下，测试每个标准溶液的吸光度，以吸光度值为纵坐标，标准溶液对应的浓度值为横坐标，绘制标准曲线。最后，将样品溶液按标准曲线绘制程序测得吸光度值，在标准曲线上查出样品溶液对应的浓度或含量。

所配制的标准溶液的吸光度在0.1～1.5Abs范围内，吸收测定的精密度可达0.5%。当摩尔吸收系数ε为105L/（mol？cm）、光程为1cm，浓度为1×10-6～1.5×10-5mol/L范围时，即可得到0.1～1.5Abs范围内的吸光度。再低一点的浓度也能检测出来，但主要取决于仪器的噪声。有时因为仪器的噪声限制，样品过稀时测量的准确度和重复性都很差。还要注意的是，分析测试的上限也不能千篇一律的定为1.5Abs。因为，杂散光的限制，有的紫外可见分光光度计仪器的检测上限达不到1.5Abs，如“75”系列紫外可见分光光度计中，有的仪器的检测上限就达不到1.5Abs。而有的仪器（如TU-1901等）可以大大超过1.5Abs，有的甚至可达3Abs以上，如美国Varian公司的Cary6000等紫外可见分光光度计。

综上所述，紫外可见分光光度计的最低检测浓度不但与摩尔吸收系数有关，而且与仪器的噪声、光谱带宽等有关。而紫外可见分光光度计的最高检测浓度，不但与摩尔吸收系数有关，而且与仪器的杂散光、光谱带宽等有关。因此，使用者要特别注意对紫外可见分光光度计的杂散光、噪声（基线平直度）、光谱带宽等的选择。

五、最小二乘法

最小二乘法实际上也就是回归方程法。因为，分光光度法中试样的吸光度A与试样的浓度C之间的关系可用一条直线来描述，即C=aA+b。因为篇幅所限，本书不对最小二乘法作详细讨论。但回归方程目前在定量分析中应用较多，如果做标准曲线时求出的回归方程差，相关系数（r）不好，则定量误差就很大。因此，提出应用最小二乘法（回归法）时，应注意两点：

1. 回归方程是在特定条件下求得的，不能随便套用。
2. 分光光度法中试样的吸光度A与试样的浓度C之间的关系，应建立在回归方程中的取值范围内，否则，不能随便外推。

六、解联立方程法

解联立方程法只适用与于两个以上、在紫外区吸收峰互不重叠组分的测定。也不是常用的方法。

七、示差分光光度法

示差分光光度法也不是紫外可见分光光度计的应用中常用的方法。本书也不作详细讨论。但应注意三点：

1. 示差分光光度法中最重要的是选择适当浓度的参比溶液。参比溶液越接近样品溶液，则测定的结果就越准确。
2. 示差分光光度法解决了普通分光光度法中不适用的高含量或痕量物质的分析问题。
3. 示差分光光度法要求紫外可见分光光度计的稳定性好、灵敏度高（噪声小、杂散光小）。