柱层析法提取菠菜中叶绿素a等成份步骤 分析

纤维素柱层析法是提取蔬菜叶绿素和有效成分的一种好方法，本文以菠菜为例，说明提取叶绿素a、叶黄素、胡萝素、脱镁叶绿素、玉米黄质的步骤。

第一步：层析柱的制备

选一支直径为1.5cm的玻璃试管，割去底部，制成长13cm的圆柱作层析柱。用一片塑料薄膜封住塑料底部，用橡皮筋勒紧，然后用针在塑料底上均匀地扎60个小7L。将固定相轻体碳酸镁疏松地装入层析柱中，装成7cm的层析柱，连接抽气瓶与抽气管组成抽滤装置，将层析柱插入抽滤瓶中进行抽滤，将固定相抽实，抽滤时间为lh。然后用粗玻璃棒的一端将层析柱上部的轻体碳酸镁压平实，使其形成圆整的平面，抽实，固定相长5cm左右。在固定相上加两片大小合适的圆形滤纸，用玻璃棒压实，使其与固定相贴紧。

第二步：试样的制备

摘取新鲜菠菜叶，去除粗大的叶脉，洗净于阴暗处晾干，称量2g放入研钵中。加入适量的无水硫酸钠和少许轻体碳酸镁中和植物细胞中的有机酸，将菠菜叶研成干粉。安装抽滤装置，将干粉转移入G4漏斗中压实，然后在漏斗中加入20ml无水乙醚，慢慢抽滤浸提，为防止乙醚大量挥发，漏斗顶部盖一层滤纸。将制得的浸提液放于阴暗处，挥发至1ml，即得试样。

第三步：试样有效成分的分离提纯

• 用滴管吸取试样，小心均匀地滴在层析柱顶部的滤纸上，使浸提液通过滤纸慢慢渗人固定相中，在层析柱内加一块玻璃棉压紧。
• 在柱顶加入5ml正己烷洗脱剂，用锥形瓶收集第一条色带的橙黄色溶液即B一胡萝h素。
• 待洗脱剂清亮无色后，将洗脱剂换成甲苯，加入层析柱中，用锥形瓶收集第二条色带的暗灰色溶液即脱镁叶绿素a。
• 继续洗脱可以得到第三条黄色带溶液即叶黄素。
• 用氯仿作洗脱剂，收集第四条黄色色带溶液即玉米黄质。
• 将洗脱剂换成石油醚：丙酮=50：3，得到第五条蓝色带溶液即叶绿素a。
• 将洗脱剂换成石油醚：丙酮：甲苯=50：3：3，得到第六条色带黄色带溶液。
• 此时层析柱中只留下最后一条灰黑色色带第七条色带，以无水乙醇洗脱，用锥形瓶收集。

第四步：成分分析

将收集的色带洗脱液稀释后用紫外可见分光光度计在350~750nm处对其扫描作图，得到各洗脱物质的吸收光谱图，如下图所示：

根据紫外光谱仪光谱学特征吸收，确定前五条色带分别为β一胡萝卜素、脱镁叶绿素a、叶黄素、玉米黄质、叶绿素a。第六条色带和第七条色带洗脱液可能分别为叶绿素的降解产物：脱镁脱植醇叶绿素和脱镁叶绿二酸。

由此可以得知，在避光操作条件下，根据以上步骤，用层析法分离新鲜菠菜叶中的成分，可以得到β—胡萝卜素、脱镁叶绿素a、叶黄素、玉米黄质、叶绿素a五种营养成分。